La hemoglobina funcionante, que es la que acepta y transporta oxígeno se presenta como oxihemoglobina y absorbe fundamentalmente la banda infrarroja (850-1.000 nm). La desoxihemoglobina o hemoglobina reducida, que no transporta oxígeno, absorbe fundamentalmente la banda roja del espectro (600-750 nm). Por eso el pulsioxímetro consiste en un fotodetector y dos diodos emisores de luz con dos longitudes de onda, 660 nm (banda roja) y 990 nm (banda infrarroja). El fotodetector y los diodos se encuentran enfrentados, estando entre ambos la piel, tejido conectivo, hueso, vasos sanguíneos, etc. Los diodos se encienden y se apagan varios cientos de veces por segundo, diferenciando la absorción durante el pulso con cada latido y cuando no hay latido. El microprocesador analiza cada longitud de onda para determinar la cantidad de oxihemoglobina y desoxohemoglobina y divide la concentración de oxihemoglobina entre la concentración de ambas para hallar la SpO2. Durante el flujo pulsátil se detecta la absorción la sangre arterial, sangre venosa y los tejidos, y durante el flujo no pulsátil se detecta la absorción por parte de la sangre venosa y los tejidos. El micropocesador compara la absorción durante el flujo pulsátil y el non pulsátil para aislar la absorción por la sangre arterial y así poder determinar la SpO2.
Los microprocesadores de los pulsioxímetros están calibrados usando tablas realizadas con voluntarios sanos con FiO2 decrecientes que produzcan SpO2 de 100 a 75% con medición del O2 en sangre de forma simultánea. Valores menores al 75% se obtienen por extrapolación. En la práctica, un punto de corte aceptado por muchos clínicos es de 80% (que suele corresponder a una PaO2 aproximada de 50 mm Hg con pH: 7.4).
La correlación entre la SpO2 y la PaO2 viene determinada por la curva de disociación de la oxihemoglobina.